回收冬虫夏草和蝠蛾昆虫的人工培育技术
要进行冬虫夏草的人工培育，首先必须大量人工饲养寄主一一蝠蛾属昆虫。蝠蛾一生中有98%的时间都在土壤内生活，仅有2.5一13d的成虫期营地面生活。所以，这类昆虫的人工饲养管理主要是在土壤中开展。
1.蝠蛾的饲养工具
(1)蝠蛾卵的饲养工具。饲养蝠蛾卵可用两种方法，一是用直径 15一20cm的玻璃培 养皿，垫上2一3层滤纸，皿内放一块吸水棉保持湿度，每皿可饲养200一500粒卵。此法利于观察，但难掌握湿度。二是用l0cm xX5一8cm的广口瓶或者25cm x 30cm的玻璃饲养 缸，内置3一5cm厚的过筛细腐殖土，种上1一2棵珠芽寥植物，把卵放养于土表至lcm深的土层中，每瓶可饲养300一1000粒卵；饲养时只要掌握住植物不枯萎，即可不加湿度。此法卵的孵化率高，但观察和移植幼虫对比较困难。
(2)幼虫的饲养工具有以下4种。
a.玻璃养虫缸：用18一25cmX30一35cm的玻璃缸，也可用标本浸泡缸，放置土壤15一25cm，种上幼虫取食的植物，把刚孵化幼虫移入缸内，每缸可饲养10一30头幼虫。
b.地下养虫箱：箱一般高30一50cm，宽20一25cm，厚3一5cm。饲养箱骨架用钢筋 焊成，上面钢筋做成提手，便于提动；宽的两面用3一5mm玻璃，便于观察虫体活动；底 和两个侧面装上16孔目的铜纱网，便于水分渗入。然后装上土壤，种植饲料植物，每箱放养20 一50头幼虫；在较坚实的地上挖一个比饲养箱体积稍大和深的槽，把养虫箱放入槽中，观察时将养虫箱提出地面，抹去外表玻璃上的土壤，即可清楚看到幼虫活动情况。
c.大型养虫笼：在半自然的状况下，选择一块排水好、土质疏松的场地，挖长12一l5m、宽2一3m、深4Ocm的深槽，底部和四周垫上尼龙纱网(最好用双层，小虫不易钻出)，再把疏松的腐殖土铲进填平，种上幼虫食物，放入幼虫饲养，每平方米可放养30一50头；该法有利于大规模饲养，但观察困难。
d.用各类盆具裸露饲养：把植物饲料洗净放入盆中，放入幼虫饲养，盆口覆盖一层黑布或者黑纸遮光。此法利于生活史观察，但要注意勤换饲料和清除粪便。
(3)蛹和成虫的饲养工具。制作长50cm、宽50cm、高55一60cm的养虫箱。底部用薄铁板或双层铜纱网封底；顶和四周用铁纱或尼龙纱封盖，前面可制成一道活动纱网门。在箱底放入10一20cm的土壤，种上植物，把蛹和成虫放养土中，此法可进行密植饲养。
2.饲养技术要点
(1)土壤的选择。土壤是蝠蛾昆虫一生中最主要的活动场所。土壤条件是否适合该虫生活是人工饲养成活率高低的关键之一。最适宜蝠蛾生长的是高山草甸土；次之是流石滩和草甸混合土；再次之是高山棕色、暗棕色林土，其他土壤对此虫生长不良。
(2)食料的选择。幼虫最喜取食圆穗蓼、珠芽蓼、黄芪、小大黄等植物的嫩根芽。由于蝠蛾昆虫是一类杂食性昆虫，在无上述植物的地方，可用禾本科 (如青稞、麦、谷芽等)；十字花科、莎草科的嫩根饲养。在中、低海拔地区(适宜生活的温度下)用土大黄、胡萝卜、白萝卜、白薯 (红苕)、马铃薯、苹果等饲喂也能正常生长发育，最好为土大黄、胡萝卜和白薯三类。
(3)温、湿度的选择。蝠蛾昆虫是一类耐低温而怕高温的昆虫。最适宜在15一19C中生活成长；此虫最适宜空气湿度75%一85%，土壤含水量40%一45%之间。
3.管理技术
(1)成虫期。成虫不取食任何食物，只要保持水分和适宜温度即能正常成活和产卵。但蛾子栖息环境与产卵量有关。成虫最喜选择有杜鹃和蝠蛾幼虫取食的蓼科等植物根旁产卵，所以在蛾子交配产卵前植上几株相关植物最佳；另外不能有强光影响。
(2)卵期。要使卵能正常孵化，一定要掌握好适宜的温、湿度。
(3)幼虫期。幼虫由于生长期长，而且虫体壁薄而易破，饲养时一定要细心，除了必要的观察、换土和换食料外，尽量减少翻动。幼虫的饲养关键是初孵的幼龄时期，初孵幼龄虫要给足细小鲜嫩、湿度不高的食物；土壤最好经过筛检，以免粗硬物擦伤主体。此外，为了延长食料和土壤不霉坏，更换前用紫外灯照射杀菌l5min，土壤也可在阳光下暴晒1一2h后再用。
(4)蛹期。养蛹时，把养蛹器皿内的土壤压实，然后用与蛹粗细的木棍人工造一土室，土室略斜，深约2一3cm，每室放一蛹，放蛹时，蛹头向土表面，上用细土盖住。蛹的温湿度，可控制在大气湿度80%一85%，土壤含水量42一45%之间，温度18一22℃之间。
(二)冬虫夏草菌的人工培养技术
要获得纯正的冬早夏草菌种必须进行人工的分离、纯化、复壮、保存等工作。
1.分离冬虫夏草菌的技术与条件
(1)材料要求。获得纯的菌种对材料要求比较严格；一般来说如果是进行冬虫夏草的组织块分离法，最佳的分离材料是每年的10月底至11月份，青藏高原高寒草甸土壤刚开始冻结时期采的材料，这个时期冬虫夏草菌刚感染蝠蛾幼虫进入僵虫期不长时间，嫩小的子座芽刚长出虫头部0.2一0.5cm，虫体内其他杂菌较少，最易进行分离。如果是第二年5一6月份采的材料，僵虫体和子座上都有许多种杂菌共生或腐生，难获得纯菌种。若用子囊孢子进行分离培养，材料最好在每年的7月中、下旬子囊孢子刚有部分成熟期采集分离培养。
(2)操作方法。有以下3步。
a.僵虫体 (即菌核)的分离：分离前，用水刷洗干净主体表面，再用无菌水清洗2一3次；用0.1%一0.2%的升汞溶液，对分离材料进行约3一5min的表面消毒；再用无菌水清洗。选取与胸足为界的前段部分。用解剖刀切去表皮，避开消化道，取血腔菌丝切成芝麻粒大小，压入平板培养基中，每皿1一2粒。置于15一19℃中培养，待菌落长出0.2一0.5cm时，挑选少量菌丝反复在平板培养基上分纯2一4 次，确定无其他杂菌后，移入试管保存和培养。
b.子座芽分离：从僵虫头顶切下洗净的子座芽，置入0.1%升汞液中消毒2一3min，用无菌水洗净，切取中间部位组织块压入培养基中；培养条件同a。
c.子囊孢子分离：用透明纸袋套住子囊孢子成熟的子座，让子囊孢子弹跳粘贴在纸袋上，然后，把有子囊孢子的纸袋浸入25%的葡萄糖液中，洗下孢子，放入15一19℃中培养，每天镜检，当袍子萌发时，用微吸管吸单个孢子滴于平板中培养；培养条件同a。也可把整个成熟的冬虫夏草带回室内，用棉纸把僵虫和连虫体的子座包住，仅留出有孕部分，在无菌室中，横放，下置一片载玻片，随时保持主体湿度；每天镜检，当看到子囊孢子弹到玻片时，用微吸管吸到平皿的培养基中培养；培养条件同a。
(3)培养基的选用。
a.马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)，此种配方是所有虫草菌属真菌的通用培养基，在分离培养初期可用该配方，不过菌种生长不十分旺盛，而且易老化、退化。
b.加富培养基 (1)：多性蛋白脐10g，葡萄糖50g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，活蚕蛹30g，生长素0.5μg，琼脂20g，加水1000mL，pH： 5.0。
加富培养基 (Ⅱ)：蛋白脯40g，葡萄糖40g，去皮鲜马铃薯100g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏10g，生长素0.5μg，蝠蛾活幼虫 (磨碎)30g，琼脂20g，高寒草甸土浸出液10OOmL，pH：5.0。
在加富培养基上，菌落比在PDA培养基上生长旺盛和迅速；加富 Ⅱ号又优于Ⅰ号。
2.生长特性 冬虫夏草菌的分离培养中须掌握温度、pH值、光照、碳和氮源及无机盐的利用状况。
(1)不同温度对菌丝生长的影响。冬虫夏草菌喜偏低温度。在0 一4℃时能缓慢生长；5一8℃时生长速度加快；10一19℃是此菌较适生长发育的范围;最佳生长温度为15一l9℃。超过20℃菌丝猛长，菌落由白色变为灰黑或棕黄色，开始出现变异，所以不宜高温培养。
(2)对pH值的要求。冬虫夏草菌是一种偏酸性真菌，最适pH值为 5.0一6.0，当pH值为4.5以下和6以上时，随着增高或降低，生长缓慢至不生长。
(3)光照的影响。此菌的子囊孢子萌发和菌丝生长初期，适应于弱光和短光照，后期则适应于较强光照。在人工培养中，菌丝、分生孢子和子座等具有明显的趋光性，向阳面生长多而密，背光面生长稀疏，全黑环境下培养的各种菌态纤弱、细长、稀疏。
(4)对碳源的利用。冬虫夏草菌可利用多种碳源，但以葡萄糖和麦芽糖合用时生长最快，单用葡萄糖时也能良好地生长，次之是马铃薯等淀粉，再次之是蔗糖。
冬虫夏草菌是一种由寄生活体寄主，再由腐生阶段发育成熟的真菌，所以对氮源中的多种有机氮均能较好的利用。而以活虫体最佳；蛋白胨与酵母膏合用生长也十分理想，次之是二者单独使用，再次之是牛肉膏等。而对无机氮如硫酸铵、硝酸钾等利用较差。 对灰分养料有一定的需求，在有微量的硫酸镁、磷酸氢二钾的培养基中生长旺盛，次之是磷酸二氢钾，其他钠、钙、铁、铜等无机盐也可利用。
3.培养方式 冬虫夏草菌分离纯化后，即可作为各种实验和扩大生产应用。
(1)其扩大生产的方法常有三种：固体静置培养法、振荡培养法和大罐通气发酵培养法。
a.静置培养：主要用在固体培养，如试管斜面、三角瓶培养、米饭培养等等。在静置培养中只要掌握好温度和光照即可使菌正常生长。当斜面上的分生孢子成熟后，即可存入1一2℃的冰箱中保存8 一14个月，也可作为种子直接用于生产。
b.振荡培养：采用液体培养菌种或小规模繁殖培养，都可用振荡培养。振荡培养的培养基，把固体培养基减去琼脂即可。设备最好选用恒温振荡培养机，用三角瓶置液体培养基，把试管固体菌种接入即可培养。经不断振荡使液体培养基中各种成分混合均匀而不致沉淀，同时促进气体与液体接触和交换，使氧进入液体培养基中，利于菌丝生长和分生孢子形成。
c.大罐通气发酵培养：在大规模生产菌丝和分生孢子等菌粉时，必须用大罐通气发酵培养法。该方法通气是采用吸气或真空泵减压等方法，经过滤器除杂菌，送入罐内液体培 养基中供冬虫夏草菌的生长发育。
(2)发酵工艺流程。自然冬虫夏草分离纯化→ 试管斜面种→ 振荡器液体一级 种→ 二级种→ 小型种子发酵种子罐→ 生产发酵罐 → 浓缩→ 喷粉干燥→ 成品菌粉。
冬虫夏草菌罐中发酵要求温度在20一25℃，罐压392.3一 686.5kPa(0.4一0.7kg/cmz)，通气量为0.5一1.OVVm*；注入发酵罐中的液体培养基为罐容的65%一75%为宜。 接种量为10%，搅拌速度为180r/min，培养时间72一96h，即可放罐浓缩和喷粉。
(3)发酵培养基多用。鲜马铃薯 (去皮)8%，蔗糖2%，玉米淀粉 0.5%，蚕蛹粉1%，蛋白胨0.4%，硫酸铵0.2%，pH值5.5一6.0。
(4)发酵培养成品标准。分生孢子即几全脱落母体孢子梗，孢子梗数量增加不明显 时，在镜下计数检查，每毫升含分生孢子18亿一 25亿个；残糖低于1%；氨基氮低于0.2mg/mL，即可成为成品菌液。
4.冬虫夏草菌回接要点 把有性型或无性型的冬虫夏草菌孢子回接到寄主昆虫体上，是人工培养有性型冬虫夏草和复壮无性型菌种的关键措施。
(1)回接时期。冬虫夏草回接关键在于选择寄主昆虫抗菌薄弱时期，一是蜕皮期；二是幼虫取食活动激烈，摩擦损伤率较高时期。
(2)回接方法。又分两种。
a.喷雾法：当饲养的蝠蛾幼虫达4一6龄虫，有1/3以上的幼虫蜕皮时，把幼虫集中，用子囊孢子或者分生孢子对入5%一10%葡萄糖液喷雾到虫体或食物上，接种后约30min，菌液在虫体上略干，把幼虫放回土壤中任其自然生活。此法感病率高，但缺点是，幼虫不易从土中取出集中，而且集中时幼虫有互相残杀的习性，虫体被咬伤后，易被杂菌感染致死，冬虫夏草菌丝未充满体腔时，伤虫就会腐烂，不能形成僵虫 (菌核)。
b.自然接触法：在大面积半自然土壤中饲养蝠蛾幼虫，定时取小样观察幼虫生长状况，当大部分幼虫适宜感病时，用饲料植物浸菌液种植和用细土拌菌接种，均匀撒入养虫的地表上，然后喷水，使菌渗入土中，幼虫取食活动时接触感染。此法寄主感染率不太高，但一经感染致病，冬虫夏草菌长势好，而且未感病的蝠蛾幼虫能正常生长，繁殖后代。
